蔡有齡,譚淑珍,吳燕

  摘要 目的 考察中藥“疣毒清”在體外對HPV的殺滅作用,以闡明其治療機理。方法從臨床切除的CA標本中提取HPV,加入中藥“疣毒清”后,在4℃下共孵,按時提取HPV-DNA,用FQ-PCR法測定其病毒含量。結果 含HPV的試管加入“疣毒清”后,經反復測試,24小時即不能測出HPV,而對照管及非相關中藥管均含同等濃度的HPV-DNA拷貝。結論 “疣毒清”具有明確的殺滅HPV的作用,這一功能闡明了它在治療CA時的機制。

  關鍵詞    尖銳濕疣,HPV,“疣毒清”(Verrucout),FQ-PCR,F-Probe

  尖銳濕疣是發病率僅次于淋病及非淋的性傳播疾病,它是由人乳頭瘤病毒感染所致,病發于兩性生殖器及肛周、尿道口,患者苦不堪言,目前在世界上尚無能殺滅該病毒的藥物,因此它的發病率居高不下,臨床上所能采用的治療方法,無論化學的、物理的或藥物的,均是以局部破壞瘤體為目的,不能殺滅病毒,除了形成局部的創面、痛苦、易感染外,且復發率極高,約為20%一40%。

  中藥“疣毒清”口服治療尖銳濕疣具有極高的療效,且復發率極低,這種局部不作處理,單純口服而能治愈疾病的機理,有可能是它具有殺滅病毒的功效,為了探討這一機理,我們利用熒光定量聚合酶鏈反應(FQ-PCR)來研究中藥“疣毒清”對病毒的殺滅作用。

  1  材料與方法

  1.1材料

  1.1.1  HPV來源:來自臨床標準的尖銳濕疣標本,切取后,用生理鹽水洗去血液,在無菌條件下,將標本剪碎,研磨成勻漿備用。標本來自兩位病人,分別制備。

  作者單位:1首都醫科大學朝陽醫院(北京市100020);2中山醫科大學達安基因診斷中心

  1.1.2 中藥標本:采用雙盲法,將藥物分別標號。測試中藥煎劑,與臨床劑型相同。

  1.1.3 主要儀器:PE5700型熒光定量PCR儀(包括電腦及軟件)。

  1.1.4 引物及熒光探針為中山醫科大學達安基因診斷中心提供的HPV6,11型FQ-PCR診斷試劑盒。

  1.2試驗方法

  1.2.1取尖銳濕疣組織勻漿0.6ml,分別加中藥標本2.4ml,對照管加生理鹽水2.4ml,置4℃冰箱內,按時提取DNA。第1次實驗及第2次實驗系同一病人的CA組織勻漿。第3次實驗系另一病人的標本勻漿。

  1.2.2 FQ-PCR反應步驟:采用常規堿裂解法提取DNA0.2ml入薄壁反應管中,同時加入一定濃度的引物、F-PROBE、dNTP、DNA聚合酶及緩沖液等,放入PE5700熒光PCR儀,93℃2min予變性后,按93℃45s,55℃120s,反復進行40個循環,定量結果由電腦軟件自動分析計算出初始拷貝數的定量結果。

  2   結果    見表1,2,3。

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  3  討論

  3.1   FQ-PCR由于將擴增與熒光探針在試管中同時進行,不需打開反應管即可給出測定結果,大大減少了污染所致的假陽性的機會,同時擴增時即使有非特異擴增物,也因F-PROBE不能與之結合而不能被破壞,測不到熒光訊號,因而極大地提高了試驗的特異性與靈敏性,保證了實驗的可靠性。

  3.2   尖銳濕疣標本中病毒含量極大,在其洗滌液中即可測得為2.1x107拷貝/ml,與組織勻漿的含量(2.8xl07拷貝/ml)相同,標本中的病毒在4℃冰箱中存活至13天仍可測出為1.6x107拷貝/ml。

  3.3   尖銳濕疣的組織勻漿在加入中藥“疣毒清”后,自24小時至13天,FQ-PCR恒定地不能再檢出病毒,而對照管及對照中藥標本管卻仍繼續維持原有濃度(1.6~5.3x106拷貝/ml),說明中藥“疣毒清”在體外具有能快速有效地殺滅尖銳濕疣病毒的能力。

  3.4  本實驗的結果,每次均有空白對照及非相關中藥對照,并經過3次重復測試,其結果均相同,證明本實驗的可重復性及可信性。

  3.5  本實驗的結果證實,中藥“疣毒清”在臨床上單純口服即能治愈尖銳濕疣,而且不再復發這一事實的機理,是由于它具有殺滅病毒的功能所致。